Publicación científica Dr.Abat | Mecanismos Moleculares de Reparación

ESTUDIO EXPERIMENTAL SOBRE LOS MECANISMOS MOLECULARES DE REPARACIÓN OBTENIDOS CON ELECTRÓLISIS (USGET) EN LESIONES MUSCULARES INDUCIDAS EN RATAS

Abat F, et al.

Introducción

Las lesiones en tejidos blandos son recurrentes en la práctica deportiva, ya sea producida por eventos traumáticos o bien por sobrecargas que superan la capacidad de respuesta de los tejidos involucrados en el movimiento. Dentro de los múltiples tipos de lesiones deportivas, revisten importancia las referentes al sistema musculo-esquelético, particularmente al tejido muscular con una incidencia de alrededor de un 30% (6). Cuando estas lesiones afectan a deportistas profesionales, debido a las numerosas implicaciones sociales y económicas existentes, es importante pronosticar con exactitud el tiempo que van a permanecer alejados de la competición, ya que una reincorporación demasiado temprana a la actividad deportiva puede provocar una recaída y agravar la lesión, sin embargo, un planteamiento terapéutico demasiado conservador entra en conflicto con los intereses económicos y deportivos (23).

Las lesiones musculares tiene como principal característica la ruptura de fibras y pueden clasificarse según el mecanismo de lesión en: a) Directas (contusión y laceración) y b) Indirectas (lesiones por elongación, dolor muscular de aparición tardía y síndrome compartimental). Sin embargo, algunos autores han propuesto clasificaciones cualitativas (25) en directa relación con la fisonomía de la lesión y su evolución. Este tipo de clasificación, que está orientada a aplicar el tratamiento óptimo y utiliza diagnostico por imagen como principal herramienta de clasificación, comprende seis tipos diferentes de desgarros considerando sus características: desgarro miofascial, desgarro fibrilar, desgarro multifibrilar, desgarro fascicular, desgarro masivo o total con o sin avulsión ósea y adherenciolisis (re-herida).

El proceso inflamatorio es una de las partes más importantes de la respuesta del sistema inmunitario a la lesión, debido a que el mecanismo bioquímico y la cascada de señales son consistentes y perdurables, independiente de la causa subyacente a la herida (12, 17). Las células no musculares, como los leucocitos fagocitos, macrófagos, citoquinas o factores de crecimiento, juegan un papel importante en el proceso inflamatorio en cuanto a la recuperación y regeneración que sigue a la lesión muscular, así como en el daño secundario que se produce durante el proceso inflamatorio. Aunque el papel exacto que juegan estas células no está del todo claro, ciertas sustancias liberadas desde la lesión muscular actúan como “mensajeros intercelulares”, dando inicio al proceso de inflamación, como es el caso de la citoquina interleuquina 1-β (IL-1β) (21). De igual forma, existe mayor evidencia que células mononucleares, que residen normalmente en el tejido muscular, son activadas por el mecanismo de lesión, las cuales proveen una señal quimiotáctica para las células inflamatorias circulantes.

Como consecuencia de la lesión muscular, se produce una vasodilatación localizada inducida por dos mecanismos; por liberación de histamina desde las células presentes dentro del área dañada (21) y mediante la activación de la ruta del Factor de crecimiento endotelial vascular-Oxido nítrico (VEGF-NO) (26). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) puede estar siendo secretado por los fibroblastos, células endoteliales o monocitos macrófagos en respuesta a la hipoxia, estrés oxidativo, factores de crecimiento y nivel de citoquinas, y activa la vía del oxido nítrico y oxido nítrica sintetasa (NOs) para facilitar la vasodilatación.

Los neutrófilos contribuyen a los eventos post-lesión de dos formas: a) la invasión de neutrófilos tiene una función fagocitaria, limpiando los desechos necróticos y b) magnifican el proceso inflamatorio a través de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, como son interleuquina 1-β (IL-1β) y interleuquina-6 (IL-6). Aunque los fagocitos y neutrófilos actúan en la fase temprana de la respuesta inflamatoria en la lesión muscular, ellos pueden causar un daño adicional al tejido muscular, pudiendo dañar el tejido sano circundante. Este proceso es llamado daño muscular secundario (21). El inicio de la resolución de la lesión está definido en el momento en que el número de neutrófilos en la región dañada comienza a declinar (10). Varios factores de crecimiento son liberados durante esta fase en el sitio de lesión, jugando un papel en el mejoramiento de la proliferación y diferenciación de mioblastos, Estos factores incluyen factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento USGETdérmico (EGF), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

La regeneración que sigue a una lesión del musculo estriado comúnmente se ve afectada por un proceso conocido como fibrosis. Si bien el proceso de fibrosis no se encuentra completamente conocido, se sabe que TGFβ-1 juega dos papeles importantes en el proceso. Por una parte, su sobre producción es la principal causa de fibrosis, por otra, inicia y perpetúa la cascada de fibrosis dentro del musculo estriado (13). Además, un exceso de TGFβ-1 induce inflamación crónica, fibrosis y acumulación de MEC. Han sido propuestos dos mecanismos a través de los cuales TGFβ-1 promueve la fibrosis (19). En el primero, TGFβ-1 estimula la producción de proteínas de la MEC al mismo tiempo que bloquea su degradación. En el segundo mecanismo, TGFβ-1 promueve la diferenciación de precursores miogenéticos provenientes del linaje de los miofibroblastos en mayor medida que de los mioblastos, acentuando la formación de fibrosos más que la regeneración muscular. Estas observaciones sugieren fuertemente que la expresión de TGFβ-1 en el musculo esquelético puede jugar un papel muy importante en la cascada de fibrosis que sigue a un daño muscular.

La Electrolisis Ecoguiada (USGET) es una técnica fisioterápica que consiste en provocar, por medio de una corriente galvánica transmitida a través de una aguja de acupuntura, una lisis localizada en la masa dañada y/o degenerada del tejido particular. Es un tratamiento que puede ser concomitante a otros. Su eficacia es mayor si el procedimiento es guiado con imagen ecográfica en tiempo real, lo cual permite introducir la aguja directamente en la zona de lesión, provocando una lisis localizada. Actualmente, dado su reciente fabricación no existen investigaciones referentes al efecto en el tejido muscular al aplicar este tratamiento (18). La técnica de electrólisis (USGET) se aplica en patologías crónicas de tejido blando, mayoritariamente en tendinopatìas. La aplicación de corriente galvánica en una solución de agua salada, produce una reacción química que provoca la disociación de las moléculas de cloruro de sodio (NaCl) y agua (H2O) en sus elementos químicos constitutivos, los cuales se reagrupan para formar nuevas moléculas, proceso llamado electrólisis. Este proceso genera la formación de moléculas de hidróxido de sodio (NaOH), gas hidrógeno (H2) y el gas cloro (Cl2). El hidróxido de sodio se comporta como una sustancia caustica, siendo un compuesto efectivo de destrucción y licuación de un tejido degenerado. La USGET es un proceso químico en el que, al introducir una aguja en la región de tejido blando dañada y aplicar corriente eléctrica galvánica, las sales del tejido intersticial combinadas con el agua dentro del tejido provocan una destrucción del tejido dañado y activan la respuesta inflamatoria para su reparación.

La hipótesis experimental es que la aplicación de la terapia de Electrólisis Percutánea Intratisular en lesión muscular inducida por Notexina provoca efectos musculares que podrían ser positivos en la recuperación del tejido muscular dañado.

Material y Métodos

Se realizó un diseño experimental 2×2 de variables independientes; tratamiento con USGET tras 7 días de lesión inducida por Notexina y lesión inducida. Se trabajó con dos variables dependientes; angiogénesis y proceso fisiológico inflamatorio. Se aplicó un modelo de “Ciego simple” entre el procedimiento de toma de muestras en el animalario y el análisis bioquímico de las muestras.
Los animales de experimentación empleados fueron ratas hembras de raza Sprague Dawley (laboratorios Charles River) de 7 meses de edad y un peso medio de 300 gramos. Criadas y mantenidas en condiciones higiénicas y de climatización controlados (humedad del 60% y con ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h), alimentadas con dieta sólida estándar y agua ad líbitum, en el animalario de la Facultad de Medicina, siguiendo la normativa del Real Decreto 1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (BOE nº 252. p p34367-34391). El trabajo cumple los requisitos éticos y ha sido aprobado por el Comité de Bioética de la Universidad (30 de abril de 2012 – A1328551658972). De una colonia de 50 especímenes se tomó una muestra aleatoria de 24 ratas para conformar los grupos del experimento, obteniendo grupo control (GC; n=6), grupo Notexina (Not; n=6), grupo tratado con USGET (n=6) y grupo tratado con Notexina+USGET (Not+USGET; n=6).

Protocolo experimental

El día cero, fue aplicado 200 µl de Notexina, a concentración de 10 µg/ml, en la zona medial del recto femoral en la extremidad izquierda de todas las ratas para inducir lesión muscular. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (90 mg/kg) vía intraperitoneal. A los siete días de lesión, al grupo USGET y grupo Not+USGET se les aplica tratamiento de USGET. por medio de una aguja de acupuntura de un diámetro de 0.32 mm, se transmitió al tendón una corriente continua de entre 3 y 6 mA, durante 5 segundos, previa anestesia de la rata. Se uso anestesia (halonato) previa aplicación de la USGET.
El grupo Notexina no fue tratado con USGET con el objetivo de observar cómo evoluciona la lesión sin recibir el tratamiento y determinar el daño inducido por Notexina a 21 días. A los veintiún días de lesión y previo al sacrificio de los animales de experimentación, se realizó examen ecográfico a todas las ratas, en ambas extremidades con el fin de evaluar la evolución de la lesión y del tratamiento aplicado a través del análisis de imagen. Se extrajo el tejido muscular de la zona de tratamiento, lesión y control, analizándose las muestras por medio de técnica electroforética e inmunodetección (Wester Blot) con el fin de identificar los mediadores metabólicos del proceso inflamatorio y determinar si el tratamiento experimental genera modificaciones respecto a la lesión inducida y al grupo control.

Se extrajo sangre de las ratas que componen cada grupo para realizar análisis ELISA de detección de citoquinas. Se utilizó el grupo control plasmático para evitar que el efecto sistémico de la lesión inducida influya en los niveles de control.
Las ratas en ningún momento fueron sometidas a entrenamiento físico, manteniéndolas dentro de sus jaulas durante el período de experimentación.

Para la inducción de la lesión muscular se inyecto en la musculatura de las ratas 2µg/kg de Notexina (Laboratorio Latoxan, Valance, Francia), 200 µl de Notexina, a concentración de 10 µg/ml. Esta dosis es inferior a la dosis letal, según información del fabricante, que es de 25 µg/kg inyectada por vía intravenosa. El grupo Notexina se lesionó la zona medial del recto femoral en la extremidad izquierda, El grupo Not+ USGET se lesionó el músculo cuádriceps izquierdo mientras que el grupo control y el grupo USGET fueron inyectados con 200 µl de suero fisiológico en la zona medial del recto femoral en la extremidad derecha, no causando lesión y sirviendo por lo tanto como grupo control y grupo control del efecto de USGET en el tejido muscular.
Los niveles de citoquinas IL-1β y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) se determinaron mediante kit ELISA (Laboratorios Thermo Scientific, Rockford, EEUU) en plasma sanguíneo de ratas control y tratadas con Notexina y Notexina + USGET.
Con el fin de cuantificar los mediadores pro-inflamatorios, se analizó TNF-α y la interleuquina-1β en el plasma sanguíneo de las ratas de los respectivos grupos. A cada celda de las placas de ELISA, se agregaron 50 µl de tampón de pre-tratamiento, 25 µl de diluyente estándar y 25 µl de muestra de plasma, dejando una hora a temperatura ambiente (20° a 25° centígrados). Se lavó 5 veces con 100 µl de solución de lavado. Se agregaron 50 µl de anticuerpo reactivo biotinilado y se dejó durante una hora. Se eliminó el extra de anticuerpo lavando con 100 µl de solución de lavado durante 5 veces. Se añadió 100 µl de solución de streptavidina-HRP por treinta minutos. Se realizó un tercer lavado con 100 µl de solución de lavado por 5 ocasiones. Se agregaron 100 µl de solución de sustrato de tetramethylbenzidine (TMB) y se dejó reaccionar durante diez minutos. Se detubo la reacción agregando 100 µl de solución de “stop”. Se midió mediante espectrofotómetro a absorbencia de 450 nm y se calcularon los resultados.

Para la extracción de proteínas de las muestras musculares se homogeneizaron en tampón de lisis A (83 ml de Tris-clorhídrico [76, 5mM] pH 6.8, 2g de dodecil sulfato sódico [SDS] y 10 ml de glicerol) con inhibidor de proteasas (1%). Se calentó la muestra a 90° C durante 10 minutos y posteriormente se sonicó durante 3 minutos. Se centrifugaron las muestras a 10000g durante 10 minutos y se extrajo el sobrenadante de cada una de las muestras. Se añadió azul de bromofenol (1%) y 2-β-mercaptoetanol (0,5 %). Posteriormente las muestras se congelaron a -20ºC. Para determinar el contenido proteico se utilizó el método de Lowry (Peterson GL. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem 1977;83:346-56.) (kit Sigma-Aldrich), usando como estándar la proteína sero-albumina bovina (BSA). Se añadió 1 ml de reactivo Lowry a cada tubo y se dejó reaccionar durante 20 minutos. Se añadió 0.5 ml de reactivo de Fenol-Folin (Sigma-Aldrich) y se dejó reaccionar durante 30 minutos en oscuridad. Se midió por espectrofotometría a λ 660 nm.

Para la obtención del patrón de polipéptidos de la muestra desnaturalizada se utilizo la técnica de electroforesis, a través de los diferentes pesos moleculares de los péptidos. Fueron usados geles de acrilamida de 0.75 mm de espesor, al 12% (gel separador) y 4% (gel condensador), en tampón de electroforesis 1x (Tris 0,25mM, Glicina 2mM y SDS 1%). Las muestras se calientaron a 90ºC durante 5 minutos para conseguir su desnaturalización. Se aplicó corriente eléctrica continua de 120 voltios hasta su separación adecuada. Las proteínas separadas por su peso molecular, fueron transferidas a membrana de nitrocelulosa, en tampón de transferencia (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, Metanol (20%), a 120 mA. (1,2mA*cm2) durante 1 hora. Una vez terminada la transferencia se procedió al bloqueo de proteínas, sumergiendo a las membranas durante 1 hora en leche desnatada al 5% en tampón Tris-borato-EDTA (TBS). Se lavaron 2 veces con TBS con Twin 20 al 0.1% (TBS-T) para eliminar bloqueante sobrante, durante 10 minutos. Se incubaron con el anticuerpo primario (en TBS-T y 2% leche) durante 2 horas a temperatura ambiente en plataforma basculante con una frecuencia de 20 oscilaciones por minuto. Las membranas se lavaron 4 veces con TBS-T durante 5 minutos, incubando posteriormente con el anticuerpo secundario (en TBS-T y 2% leche) durante 1 hora a temperatura ambiente en plataforma basculante con una frecuencia de 20 oscilaciones por minuto. Con el fin de visualizar la expresión proteica del anticuerpo incubado, las membranas fueron colocadas sobre una placa de revelado añadiendo a la membrana solución de revelado ECL Western Blotting Substrate (Peroxide Solution y Luminol Enhahcer Solution) y se dejó reaccionar durante 1 a 5 minutos. Las membranas fueron sometidas a revelado por fotoluminiscencia en sistema captador de imágenes.

Se utilizaron los anticuerpos monoclonales anti-factor de crecimiento endotelial vascular receptor 1 (VEGF-R1) (1:1000), anti-tubulina (1:1000) y anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (1:1000). Los anticuerpos fueron obtenidos de SIGMA-ALDRICH, Madrid, España.

Resultados

Los niveles del factor pro-inflamatorio TNF-α, en ratas lesionadas con Notexina, mostraron una disminución significativa de la concentración plasmática en relación al grupo Control. Además, se objetivó una diferencia significativa en la concentración de TNF-α comparando el grupo tratado con USGET + Notexina (p<0.05) y el grupo solo con Notexina (p<0.05). Por otro lado, la aplicación del tratamiento USGET tras Notexina produjo recuperación de la liberación TNF-α a niveles control. Se objetivó un incremento significativo en la concentración de la citoquina pro-inflamatoria interleuquina-1β en el grupo inyectado con Notexina en relación al grupo control. El grupo Notexina + USGET muestra una disminución significativa de la concentración de IL-1β en relación al grupo Notexina, en cambio no muestra diferencias significativas con respecto al grupo control. La aplicación de USGET al músculo lesionado con Notexina mostró una disminución en la concentración de IL-1β en plasma comparado con el grupo Notexina. Dada la presencia de vascularización en el músculo in vivo analizado mediante imagen ecográfica, el análisis de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular mediante la técnica de electroforesis e inmunodetección para determinar los efectos en angiogénesis en el músculo tratado, mostró que la administración de Notexina intramuscular produjo un aumento significativo de la expresión proteica del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con respecto al grupo control. La aplicación de la técnica USGET ocasionó un aumento de la expresión proteica de VEGF también significativa con respecto a control. La aplicación de USGET tras el daño ocasionado por la Notexina, aumentó la expresión de la proteína VEGF, sin apreciarse diferencias significativas (p>0.05) entre este grupo y el grupo solo con Notexina y/o solo con USGET.
Debido a que se observó un aumento en el VEGF, se procedió a analizar si la técnica USGET producía cambios en la expresión de su receptor 1 (VEGF-R1).

La administración de Notexina produjo un aumento significativo (p<0.05) en la expresión del receptor con respecto a la rata control. La aplicación de la USGET indujo también un aumento significativo de VEGF-R1, indicando que la USGET podría estar afectando la eliminación del receptor y/o su transcripción. La aplicación de la USGET a los siete días de lesión con Notexina, aumento de manera muy significativa (p<0.05) la proteína VEGF-R1 con respecto a control y con respecto al grupo con Notexina.

Discussion

El principal hallazgo del presente trabajo es que la USGET disminuye la cicatriz fibrótica en la lesión aguda del músculo y la lesión hipóxica secundaria. A nivel clínico esto nos permitiría sustituir el tratamiento conservador de reposo en a la fase aguda e iniciar el tratamiento con USGET a las 48h post-lesión para controlar desde el principio de la fase fibrótica el proceso de cicatrización y evitar la lesión hipóxica secundaria, optimizando el proceso de curación reparación y regeneración del tejido muscular.

Los resultados mostrados indican a su vez una disminución de TNF-α en plasma de ratas cuando se aplica Notexina. Estos datos parecen contrarios a lo publicado por la mayoría de los autores a los pocos días de lesión (5, 14). No obstante, hay que tener en cuenta que la medición del factor se realizó, 21 días después de la lesión, momento en el que numerosos autores indican una disminución del factor en plasma y un comienzo en la cronicidad de la lesión. Por otro lado, los niveles de TNF-α llegan a valores control en el caso de Notexina+USGET y por lo tanto a condiciones normales. Se cree que este hecho sería un indicativo de la posible regeneración potenciada por la técnica USGET.

Por el contrario, la Notexina ocasionó un aumento significativo de IL-1 incluso a 21 días con respecto a control, indicando que la citoquina presenta un aumento durante el tiempo mayor que en el caso de TNF-α. El factor de necrosis tumoral en numerosos procesos se mantiene menos en el tiempo en condiciones elevadas, debido a su actuación sobre la necrosis celular (2). Cabe destacar, que no existe mortalidad en la muestra debido a que el tratamiento no genera daño sistémico, aunque sí que ha detectado afectación en el proceso inflamatorio. Futuros experimentos deben realizarse para analizar este hecho.
El mantenimiento de IL-1 en el tiempo ha sido relacionado con su condición de citoquina pro-inflamatoria más que por su acción en la pirosis y necrosis de tejido (14). Cuando se aplica la USGET tras la Notexina, la citoquina IL-1 adquiere valores normales a 21 días de lesión. Por lo tanto, la USGET estaría inhibiendo la inducción a largo plazo de los mediadores pro-inflamatorios a nivel sistémico.

La USGET provoca en nuestro modelo una recuperación a niveles controles de mediadores pro-inflamatorios en plasma seguramente inhibiendo la activación de apoptosis y/o necrosis en zonas no dañadas, musculares o sistémicas.
En próximos estudios se pretende analizar la acción de mediadores anti-inflamatorios en plasma, como son la IL-10 e IL-4. Además, se debería analizar la apoptosis y la necrosis en el tejido dañado.

Para analizar la angiogénesis del tejido dañado, medimos VEGF tras daño con Notexina y tras Notexina+USGET. Nuestros resultados indican una inducción clara de VEGF tras el daño inducido por Notexina, que hasta donde los autores conocen ningún autor ha publicado con anterioridad y como ocurre a numerosos autores induciendo daño por otros modelos (11, 13). La acción de la USGET sola o de la Notexina+USGET, produce activación de VEGF indicando vascularización nueva en la zona dañada, posiblemente para una regeneración del tejido dañado.

Previamente se ha publicado que el receptor que se induce más activamente tras inflamación es el VEGF-R1 (8), se procedió a medir en primer lugar este receptor. Como se esperaba, Notexina o USGET por si sola inducían VEGF-R1, resultados que aún no han sido publicado ni con Notexina sola ni con Notexina+USGET, pero que si ha sido analizado para otros tóxicos (4) o modelos mecánicos (8). Al aplicar USGET tras 7 días del daño inducido por Notexina, se observa un aumento muy significativo respecto a control de esta proteína, indicando que las células del músculo mantienen el receptor por más tiempo en su membrana (teóricamente habría una menor endocitosis de receptor) y/o que la transcripción de la proteína del receptor estaría más inducida.

El trabajo presenta algunas limitaciones como puede ser el uso de ratas por lo que el resultado puede no ser extrapolable en humanos. A pesar de ello las ratas han sido utilizadas en múltiples estudios (28). Otra limitación es el numero de animales a de ensayo por grupo de dosis (n=6).

A pesar de las limitaciones explicadas el presente trabajo es la primera investigación sobre el efecto de la USGET en tejido muscular, mostrando los mecanismos biomoleculares desencadenados por la aplicación de la misma. Este trabajo experimental es la base sobre la que se deben desarrollar trabajos clínicos para confirmar la eficacia de la USGET también en humanos.

Conclusiones

La aplicación de USGET en musculo de rata previamente lesionado con Notexina provoca una reducción de la fibrosis, núcleos de calcificación y extensión de la lesión inducida. Así mismo la USGET provoca un aumento significativo de TNF-α, una disminución de los niveles IL-1β y un aumento del factor VEGF y VEGF-R1. En conclusión, el uso de USGET reduce los efectos del proceso inflamatorio sobre tejido muscular con lesión inducida con Notexina e influye en la nueva vascularización de la zona dañada.

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